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武
Shandong Lvdu Bio-Sciences&Technology Co.,Ltd.
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一、生產(chǎn)定量
1．生產(chǎn)材料
1.1 包被液
1.2 磷酸鹽緩沖液
1.3 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
1.4 樣品稀釋液
1.5 封閉液
1.6 抗體稀釋液A1
1.7 酶稀釋液E1/E2
1.8 洗滌液
1.9 底物液A液
1.10 底物液B液
1.11 終止液
2．使用儀器設(shè)備
2.1 冰箱
2.2 生化培養(yǎng)箱
2.3 洗板機(jī)
2.4 酶標(biāo)儀
2.5 渦旋儀
2.6 天平（感量0.01）
2.7 氮吹儀
3．EL1SA檢測方法的建立
3.1 多因素正交試驗(yàn)（抗原*包被濃度及抗體工作濃度的確定）
在ELISA實(shí)驗(yàn)中必須首先對抗原的*包被濃度以及抗體的工作濃度予以選擇，從而達(dá)到抗原抗體二者之間的*反應(yīng)條件。ELISA實(shí)驗(yàn)中通常采用正交試驗(yàn)來對二者之間的*反應(yīng)條件進(jìn)行確定（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2.1）。
表2.1 ELISA加樣示意表
| 抗體稀 釋倍數(shù) | 抗原稀釋倍數(shù) | |||||
| 1 : 10 000 | 1 : 20 000 | 1 : 40 000 | 1 : 80 000 | 1 : 160 000 | 1 : 320 000 | |
| 1:10000 | | | | | | |
| 1:20000 | | | | | | |
| 1:40000 | | | | | | |
| 1:80000 | | | | | | |
| 1:160000 | | | | | | |
| 1:320000 | | | | | | |
具體操作步驟如下：
① 包被：將包被抗原用包被緩沖液做系列稀釋，每孔取100 mL加入酶標(biāo)板，包被條件如下：
| 包被溫度 （℃） | 包被時(shí)間 （hour） | |||||
| □ 4℃ | □ 27℃ | □ 37℃ | □ 2 h | □3 h | □18h | □24h |
② 洗板：甩去孔內(nèi)液體，用洗板機(jī)洗滌微孔2次（或每孔加入250 mL洗滌緩沖液洗滌），每次靜置10 s，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上拍干；
③ 封閉：每孔加入180 mL封閉液，37 ℃放置1.5 h；甩去孔內(nèi)液體，不經(jīng)洗滌直接在吸水紙上拍干；
④ 烘干：采取再次烘干或者晾干的方式*干燥酶標(biāo)板。烘干：37 ℃倒置（不加蓋板膜或用自封袋），每5塊板烘干30 min，隨著板子數(shù)量增多時(shí)間相應(yīng)延長，如100塊板，需要烘3 h，一次類推；晾干：底部鋪一層干凈的A4紙或者吸水紙，倒置板子，在頂層鋪一層蓋住避光，室溫晾18-24h。
⑤ 正交試驗(yàn)：根據(jù)不同的檢測物質(zhì)采用一步法或兩步法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
（1）一步法操作步驟：
取出所需的不同包被濃度的板條，按照設(shè)計(jì)的對應(yīng)孔每孔依次加入50 mL 包被液（零標(biāo)準(zhǔn)）、50 mL 1000倍稀釋的HRP酶標(biāo)物、50 mL系列稀釋的抗體，孵育條件如下：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時(shí)間 （min） | ||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔內(nèi)液體，每孔加入250 mL洗滌緩沖液，靜置20 s后，再次甩去孔內(nèi)液體。重復(fù)洗滌微孔3次，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育條件如下表：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時(shí)間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
終止：每孔加入50 mL 終止液；
讀數(shù)：用酶標(biāo)儀在雙波長450 / 630 nm測定每孔OD值，分析軟件分析數(shù)據(jù)。
（2）兩步法操作步驟：
取出所需的不同包被濃度的板條，按照設(shè)計(jì)的對應(yīng)孔每孔加入50 mL 包被液（零標(biāo)準(zhǔn)）和50 mL系列稀釋的抗體，孵育條件如下：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時(shí)間 （min） | ||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔內(nèi)液體，每孔加入250 mL洗滌緩沖液，靜置20 s后，再次甩去孔內(nèi)液體。重復(fù)洗滌微孔3次，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；
酶標(biāo)物：每孔加入100 mL 1000倍稀釋的HRP酶標(biāo)物，孵育條件如下；
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時(shí)間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □15 min | □20 min | □30 min |
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育條件如下表：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時(shí)間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
終止：每孔加入50 mL 終止液；
讀數(shù)：用酶標(biāo)儀在雙波長450 / 630 nm測定每孔OD值，分析軟件分析數(shù)據(jù)。
針對上述結(jié)果，選擇OD值在2.200 - 2.500范圍內(nèi)所對應(yīng)的抗原、抗體稀釋倍數(shù)，然后根據(jù)此條件下建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線及IC50值等條件，進(jìn)一步確定包被抗原和抗體的工作濃度。
3.2 酶標(biāo)免疫測定程序（標(biāo)準(zhǔn)曲線工作條件的選擇）
（1）一步法操作步驟：
選擇抗原合適包被濃度的板條，按照設(shè)計(jì)的對應(yīng)孔每孔依次加入50 mL 標(biāo)準(zhǔn)品/樣品、50 mL 1000倍稀釋的HRP酶標(biāo)物、50 mL合適濃度的抗體，孵育條件如下：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時(shí)間 （min） | ||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔內(nèi)液體，每孔加入250 mL洗滌緩沖液，靜置20 s后，再次甩去孔內(nèi)液體。重復(fù)洗滌微孔3次，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育條件如下表：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時(shí)間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
終止：每孔加入50 mL 終止液；
讀數(shù)：用酶標(biāo)儀在雙波長450 / 630 nm測定每孔OD值，分析軟件分析數(shù)據(jù)。
（2）兩步法操作步驟：
選擇抗原合適包被濃度的板條，按照設(shè)計(jì)的對應(yīng)孔每孔加入50 mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和50 mL合適濃度的抗體，孵育條件如下：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時(shí)間 （min） | ||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □ 20 min | □30 min |
洗板：甩去孔內(nèi)液體，每孔加入250 mL洗滌緩沖液，靜置20 s后，再次甩去孔內(nèi)液體。重復(fù)洗滌微孔3次，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；
酶標(biāo)物：每孔加入100 mL 1000倍稀釋的HRP酶標(biāo)物，孵育條件如下；
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時(shí)間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □15 min | □20 min | □30 min |
底物：加入底物A 50 mL /孔和底物B 50 mL /孔，孵育條件如下表：
| 孵育溫度 （℃） | 孵育時(shí)間 （min） | |||
| □ 室溫（25℃） | □ 37℃ | □10 min | □15 min | □20 min |
終止：每孔加入50 mL 終止液；
讀數(shù)：用酶標(biāo)儀在雙波長450 / 630 nm測定每孔OD值，分析軟件分析數(shù)據(jù)。
針對不同條件下產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇能夠滿足要求的抗原抗體工作濃度。曲線要求零標(biāo)準(zhǔn)的OD值在2.200 - 2.500范圍內(nèi)，線性要求大于0.99，B點(diǎn)結(jié)合率介于75%-90%之間，拐點(diǎn)≤2；IC50介于中間標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)。
3.3注意事項(xiàng)
3.1 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，待其*回升至室溫（20～25 ℃）后方可使用。注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
3.2 洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3.3 反應(yīng)終止液為硫酸，避免接觸皮膚。
3.4 生產(chǎn)定量標(biāo)準(zhǔn)
3.4.1 溶液配置體積按照入庫數(shù)量配置，避免浪費(fèi)；
3.4.2 零標(biāo)準(zhǔn)的OD值入庫時(shí)控制在2.200-2.500；
3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性要求大于0.99；
3.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的拐點(diǎn)≤2；
3.4.5 IC50值介于中間標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)；
3.4.6 B點(diǎn)結(jié)合率介于75%-90%之間。
3.5 生產(chǎn)定量要求
3.5.1 入庫分裝用的試劑配制好后，避免直接使用原瓶試劑，特別是需要多次使用的溶液，應(yīng)分裝出需要體積兩倍的溶液單獨(dú)使用，避免分裝用原瓶試劑污染。
3.5.2 配置酶標(biāo)物的試劑瓶應(yīng)采用滅菌過的試劑瓶，其余試劑組分不需要采用滅菌試劑瓶。
3.5.3 配置用溶液無論體積多少，使用前均需檢查外觀是否渾濁或污染，然后再配制半成品溶液。
3.5.4 每生產(chǎn)一批及時(shí)填寫生產(chǎn)定量批記錄表（如下表），由生產(chǎn)部負(fù)責(zé)備檔以便后期追蹤審查。
一、 生產(chǎn)檢驗(yàn)
1．指標(biāo)要求
食品安全ELISA試劑盒入庫前需滿足的指標(biāo)要求如下：
1.1 零標(biāo)準(zhǔn)的OD值入庫時(shí)控制在2.200-2.500；
1. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性要求大于0.99、拐點(diǎn)≤2 、B點(diǎn)結(jié)合率介于75%-90%之間；
1. 3 IC50值介于中間標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)；
1.4 陰性樣本背景值≤檢測限；
1.5 加標(biāo)回收率介于70%-130%之間。
2. 檢驗(yàn)
2.1生產(chǎn)定量后由生產(chǎn)負(fù)責(zé)人按照規(guī)定的檢驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行*次檢驗(yàn)，并填寫試劑盒入庫檢驗(yàn)報(bào)告單，各指標(biāo)符合要求后轉(zhuǎn)交質(zhì)控負(fù)責(zé)人進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)，并填寫試劑盒入庫檢驗(yàn)報(bào)告單（如下表）。
2.2 質(zhì)控合格的由質(zhì)控負(fù)責(zé)人簽字生產(chǎn)檢驗(yàn)單，告知生產(chǎn)部門及時(shí)入庫。
2.3 生產(chǎn)檢驗(yàn)單由質(zhì)控負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)備檔以便后期追蹤審查。
二、 產(chǎn)品包裝
1. 生產(chǎn)部按照要求將檢驗(yàn)合格的產(chǎn)品及時(shí)分裝入庫，各試劑核對無誤，方可分裝；分裝時(shí)要求環(huán)境潔凈，分裝人需帶一次性口罩，分裝不同液體使要及時(shí)更換槍頭并且要慢吸防止倒吸，造成交叉污染。
2. 及時(shí)填好生產(chǎn)包裝批記錄表（如下表），由生產(chǎn)部負(fù)責(zé)備檔以便后期追蹤審查。
四、產(chǎn)品質(zhì)控
1. 半成品管理
1.1 半成品要妥善保存，注明名稱，日期，負(fù)責(zé)人名字，再次使用前檢查外觀是否渾濁或污染，確認(rèn)無誤后方可使用。
1.2 對放置超過3個(gè)月的以及外觀不正常的試劑及時(shí)清理。
2. 成品管理
2.1 試劑盒分裝后，留出一盒48T放置留樣庫，其余放置成品庫。
2.2 由質(zhì)控負(fù)責(zé)人按照入庫時(shí)間計(jì)時(shí)，隔半月、1.5月、3月、6月及時(shí)進(jìn)行質(zhì)控，查看標(biāo)準(zhǔn)曲線情況，并填寫檢測試劑盒質(zhì)控明細(xì)表（如下表），對不符合要求的試劑盒及時(shí)通知生產(chǎn)部門解決。
2.3 庫存超過三個(gè)月的試劑盒根據(jù)質(zhì)控情況更換批次或者更換關(guān)鍵試劑，重新入庫，由生產(chǎn)部負(fù)責(zé)管理，對整改入庫的試劑盒及時(shí)填寫整頓單，由生產(chǎn)部負(fù)責(zé)備檔以便后期追蹤審查。
2.4質(zhì)控報(bào)告模板統(tǒng)一，每批次試劑盒的質(zhì)控曲線，一定注明單位（一般為ppb），采用清晰的截圖方式，例如下圖所示。
2.5 每個(gè)試劑盒均附有一份質(zhì)控報(bào)告，質(zhì)控報(bào)告由質(zhì)控負(fù)責(zé)人簽字后方可裝入試劑盒。
五、發(fā)貨管理
1. 報(bào)單記錄
銷售人員在明確客戶名稱、地址、產(chǎn)品、規(guī)格、單價(jià)、數(shù)量等信息后，及時(shí)記錄報(bào)貨明細(xì)，核對明細(xì)后詳盡地填制到《發(fā)貨申請單》上；然后通過、傳真、網(wǎng)絡(luò)等方式報(bào)單至相應(yīng)部門負(fù)責(zé)人。
2. 銷售合同
根據(jù)客戶需求制作銷售合同（如下圖），雙方達(dá)成一致后，待客戶按照賬戶匯款成功后，試劑盒發(fā)貨相應(yīng)部門進(jìn)行備貨、制單、發(fā)貨。
3. 制單
相關(guān)部門根據(jù)《發(fā)貨申請單》，編制《發(fā)貨單》。“發(fā)貨單”為五聯(lián)單，即存根聯(lián)、記賬聯(lián)、出庫聯(lián)、客戶聯(lián)和回單聯(lián)。*聯(lián)“存根聯(lián)”留存，其它四聯(lián)全部交由銷售人員分別送至物流部門及銷售會(huì)計(jì)，進(jìn)行組織發(fā)貨及銷售臺(tái)賬記賬。其中：銷售會(huì)計(jì)接收一聯(lián)（計(jì)賬聯(lián)），物流部門接收其中的三聯(lián)單據(jù)（出庫聯(lián)、客戶聯(lián)及回單聯(lián)），即：
第二聯(lián)“記賬聯(lián)”——銷售會(huì)計(jì)接收，用于銷售臺(tái)賬的記賬及留存。
第三聯(lián)“出庫聯(lián)”——用于部門內(nèi)部出庫及留存；
第四聯(lián)“客戶聯(lián)”——隨貨同行，客戶驗(yàn)收貨物后簽收留存；
第五聯(lián)“回單聯(lián)”——隨貨同行，客戶驗(yàn)收貨物后簽字蓋章，留待業(yè)務(wù)員回收、記賬后上交營銷中心轉(zhuǎn)銷售會(huì)計(jì)上賬后留存；
4. 收單、記錄、上賬
銷售業(yè)務(wù)人員必須按規(guī)定，在60天內(nèi)將發(fā)貨單的“回單聯(lián)”從客戶手中回收，回收的“回單聯(lián)”必須有客戶的簽收確認(rèn)（簽名/蓋章）及業(yè)務(wù)員簽字。若有特殊情況（如回單丟失、金額不符等），則必須由客戶出具相關(guān)證明材料，注明金額等詳情，并簽字/蓋章，寄回或由業(yè)務(wù)員帶回公司，進(jìn)行審批、上賬。若無客戶的證明材料，則由責(zé)任業(yè)務(wù)員在公司財(cái)務(wù)留存的“送貨單（記賬聯(lián)）”上簽字確認(rèn)，承擔(dān)該批貨物的完整接收責(zé)任。
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